Chkalov tử nạn vào ngày 15 tháng 12 năm 1938 khi đang lái một nguyên mẫu của máy bay chiến đấu Polikarpov I-180 và chiếc máy bay đã bị rơi trong chuyến bay thử nghiệm đầu tiên của nó. Chuỗi sự kiện dẫn đến vụ tai nạn không hoàn toàn rõ ràng. Cả hai nhà thiết kế chính của chiếc máy bay, Nikolay Polikarpov và Dmitry Tomashevich, đều không chấp thuận chuyến bay và cũng không ai ký đơn giải phóng nguyên mẫu khỏi nhà máy. Trong mọi trường hợp, thì Chkalov đều đã cất cánh và thực hiện một vòng bay ở độ cao thấp quanh sân bay. Đối với vòng thứ hai, Chkalov bay xa hơn, leo tới hơn 2.000 m (6.560 ft) mặc dù kế hoạch bay đặc biệt cấm vượt quá 600 m (1.970 ft). Chkalov rõ ràng đã tính toán sai cách tiếp cận hạ cánh của mình và đến gần sân bay, nhưng khi ông cố gắng điều chỉnh cách tiếp cận của mình, động cơ đã bị tắt đột ngột. Chkalov đã có thể tránh một số tòa nhà, nhưng lại đụng phải một đường dây điện trên cao. Ông bị văng ra khỏi buồng lái, bị thương nặng và chết sau đó hai giờ. Tro cốt của ông được cất trong Nghĩa trang tường Điện Kremli.

Cuộc điều tra chính thức của chính phủ kết luận rằng động cơ bị tắt đột ngột do nó bị quá lạnh khi không có nắp che. Những người khác đưa ra giả thuyết rằng Chkalov đã tăng ga quá nhanh và do đó làm ngộp động cơ. Hậu quả của vụ tai nạn là Tomashevich và một số quan chức khác, những người hối thúc chuyến bay đầu tiên, ngay lập tức bị bắt. Nhiều năm sau, một đồng nghiệp là phi công thử nghiệm Mikhail Gromov đã đổ lỗi cho các nhà thiết kế vì lỗi làm mát động cơ và chính Chkalov đã đi chệch khỏi kế hoạch bay. Con trai của Chkalov tuyên bố rằng kế hoạch ám sát cha mình đã được thực hiện trong những tháng trước khi ông qua đời, nhưng hoàn cảnh của vụ tai nạn khiến việc ám muội như thế khó có thể xảy ra. Bất chấp ý kiến của một số người, sau cái chết của Chkalov, danh tiếng của Polikarpov với Stalin vẫn còn nguyên vẹn, và Polikarpov tiếp tục công việc thiết kế máy bay.